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為什麼設計公式決定了分析成敗？ 很多研究人員常常忽略一個事實：RNA-seq 分析出錯最常見的地方，不在於統計模型本身，而是在於 如何將生物學問題正確轉換成統計語言。 在 DESeq2 中，設計公式（design formula）就像是一張藍圖，它告訴程式：

• 你的生物問題是什麼
• 你想比較哪些條件
• 又要如何處理實驗中的雜訊與批次效應 如果設計正確，DESeq2 會給你清晰可靠的結果；若設計錯誤，即使你的實驗做得完美，分析也可能得出錯誤結論。 好消息是：只要理解設計公式背後的邏輯，選擇正確的模型其實非常直觀。

設計公式的三大功能

1. 指出哪些因子會影響基因表現（如處理條件、基因型、批次等）
2. 定義你想比較的條件（例如「處理組 vs 對照組」）
3. 控制潛在混雜變數（如批次效應、個體差異）

設計公式的一般格式為：

design = ~ confounders + biological_factors

常見的實驗設計範例

1. 簡單兩組比較

場景：單純比較處理組與對照組

design = ~ condition
results(dds, contrast = c("condition", "treated", "control")) #contrast 放: 要比較哪個因子，這個因子裡面的哪兩個需要比較？

• 適用：只有一個研究因子的乾淨實驗。

2. 多組條件比較

場景：多種處理與對照比較

design = ~ treatment
results(dds, contrast = c("treatment", "drugA", "control"))
results(dds, contrast = c("treatment", "drugB", "control"))
results(dds, contrast = c("treatment", "drugA", "drugB"))

• 適用：多藥物比較、劑量反應、時間序列實驗。

3. 配對/重複測量設計

場景：同一位病人治療前後的樣本

design = ~ patient + condition

作用：

• 消除個體差異影響
• 專注於治療效果
• 能大幅提升統計效能

4. 批次效應校正

場景：樣本在不同天數或不同人處理

#常用
design = ~ batch + condition

作用：

• 抑制技術性差異
• 更準確評估生物學效果
• 幾乎所有實驗都建議納入批次因子

5. 因子交互作用設計

場景：想檢驗不同因子之間是否有交互作用

design = ~ genotype + treatment + genotype:treatment

作用：

• 主要效應：基因型差異
• 主要效應：處理差異
• 交互作用：不同基因型對治療的反應是否不同 在 DESeq2 中，若設計公式包含交互作用，模型會同時估計主效應與交互作用效應；透過 resultsNames(dds) 可以找到交互作用項（如 genotypeKO.treatmentdrug），並用 results(dds, name="genotypeKO.treatmentdrug") 提取結果，取得 log2FC、p 值與 padj。 若交互作用顯著，表示 treatment 效果會依 genotype 而異，此時主效應不能單獨解讀，必須關注不同組合下的差異並搭配圖表呈現。

設計公式的實用原則

順序很重要 混雜因子要放在前面，感興趣的生物因子放在最後：

# 正確
design = ~ batch + sex + treatment

# 錯誤
design = ~ treatment + batch + sex

保持簡單

• 小樣本只適合簡單設計
• 複雜設計需要更多重複數才能保證結果穩健 建議樣本數： 設計類型 最低需求 建議數量 簡單 (~ condition) ≥3 5–6 含批次 (~ batch + cond.) ≥3 4–5 因子交互 (~ A + B + A:B) ≥3/組合 5–6/組合 時間序列 (~ time) ≥3/時間點 4–5/時間點

計數矩陣的最佳實踐

移除低表達基因

keep <- rowSums(counts(dds)) >= 10
dds_filtered <- dds[keep, ]

好處：減少噪音，提高統計檢出力。

正確設定參考組

levels(dds$condition)            # 查看順序
dds$condition <- relevel(dds$condition, ref = "control")
levels(dds$condition)            # 確認 control 在第一位

• 影響：正確解讀正負 fold change 的方向。

常見錯誤與解法

忽略批次效應

問題：樣本可能按照處理日期聚集，而不是生物條件

解法：加上批次因子

design = ~ batch + condition

設計過於複雜 問題：因子太多、樣本太少 → 結果不穩定 解法：先用簡單模型，再逐步增加複雜度 錯誤的參考組 問題：DESeq2 預設按字母排序 解法：手動指定 control 為參考組

實際應用案例

時間序列實驗 design = ~ time 每個時間點至少 3–5 個生物重複 臨床試驗（含批次） design = ~ batch + sex + treatment 控制技術差異與性別影響，聚焦治療效果 藥物組合實驗 design = ~ drugA + drugB + drugA:drugB 檢驗單藥效應與交互作用（協同或拮抗）

完整流程範例

1. 建立 DESeq2 對象

dds <- DESeqDataSetFromMatrix(counts, colData = metadata, design = ~ 1)

2. 檢查實驗因子

table(dds$condition) table(dds$batch)

3. 設定參考組

dds$condition <- relevel(dds$condition, ref = “control”)

4. 指定設計公式

design(dds) <- ~ batch + condition

5. 移除低表達基因

keep <- rowSums(counts(dds)) >= 10 dds <- dds[keep, ]

6. 驗證

print(dds) print(design(dds)) print(levels(dds$condition)) 完成以上步驟後，就可以進入 DESeq2 的差異分析流程。